产品简介：

Cell Counting Kit-8，简称 CCK-8 试剂盒，是一种基于 WST-8 而广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速、高灵敏度、无放射性的比色检测试剂盒。CCK-8 溶液可以直接加入到细胞样品中，不需要预配各种成分。WST-8 在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的formazan (Fig.1)。

 Fig.1  WST-8与WST-8 formazan化学结构

细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。对于同样的细胞，颜色的深浅（生成的formazan量）和细胞数目呈线性关系（Fig.2）。

Fig.2  CCK-8检测原理

WST-8是MTT的一种升级替代产品。WST-8较MTT、XTT等产生的formazan为水溶性，且水解度更高，实验结果更加稳定，相比线性范围更宽，灵敏度更高。

WST-8和WST-1相比，检测灵敏度更高，更易溶解，并且更加稳定。

酚红和血清对本试剂盒的测定无明显影响。

WST-8对细胞无明显毒性，加入 CCK-8 溶液显色后，可以在不同时间反复用酶标仪读板，检测时间更加灵活，便于确定最佳测定时间。

保存条件：

4℃避光保存一年有效，-20℃避光保存两年有效。

注意事项：

1. CCK-8的孵育时间一般为 1-4小时，但在孵育30分钟左右即可取出肉眼观察显色程度，根据细胞种类而定，需要摸索条件，CCK-8的最佳反应时间以具体显色的最佳时间为准。

2. 使用96孔板进行检测时，如果细胞培养时间较长，注意蒸发问题。

3. 本试剂盒的检测依赖于脱氢酶催化的反应，所以还原剂（例如一些抗氧化剂）会干扰检测，如果待检测体系中存在较多的还原剂，需设法去除。

4. 用酶标仪检测前需确保每个孔内没有气泡，否则会干扰测定。

5. 加入药物中如含有金属，对CCK-8显色有影响。终浓度为1 mM的氯化亚铅、氯化铁、硫酸铜会抑制5%、15%、90%的显色反应，使灵敏度降低。如果终浓度是10 mM的话，将会100%抑制。

6. 培养基中的酚红不会影响实验结果，酚红的吸光度可以在计算时，通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不会对检测造成影响。

7. 要测定细胞的具体数量，建议同时做标准曲线。

8. 建议采用排枪，以减小平行孔间的差异。

9. 反应停止后，应在24小时内完成测定。

10. 本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品。

11. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用方法：

细胞数测定

1. 在96孔板中接种细胞悬液（100 μL/孔）。 在细胞培养箱中进行预培养（如37 ℃, 5% CO2）。

2. 在96孔板的每个孔中加入10 μL CCK-8溶液。小心不要将气泡引入孔中，气泡会干扰 OD值读数。

3. 将孔板在培养箱中孵育1-4小时。

4. 使用酶标仪测量450 nm处的吸光度。向每个孔中加入10 μL 1% w/v SDS或0.1 M HCl，盖住96孔板并在室温下避光保存，可延长测量时间。

具体步骤（以6孔板为例，其他培养形式的转染参见下表）：

1. 将细胞以104-105个细胞/孔的密度接种在96孔板中，加入100 μL培养基，含或不含待测化合物。在CO2培养箱中在37 ℃下培养细胞24小时。

2. 向板中加入10 μL不同浓度的待测物质。

3. 在培养箱中将培养板培养适当时间（如6、12、24或48小时）。

4. 向板的每个孔中加入10 μL CCK-8 溶液。小心不要将气泡引入孔中。

5. 将孔板在培养箱中孵育1-4小时。

6. 在读板之前，在定轨振荡器上轻轻混匀。

7. 使用酶标仪测量450 nm处的吸光度。