产品简介：

     佰欧晶慢病毒包装试剂盒（Lentiviral Packaging Kit）由优化的慢病毒包装辅助质粒MIX、GFP对照质粒、高效转染试剂（NanoTrans 20™）、病毒浓缩液和感染辅助试剂组成，同时具有以下优势：

（1）慢病毒包装时间周期短：一周之内即可拿到纯化好的高滴度慢病毒；

（2）使用简单便捷：转染级质粒可直接使用，病毒浓缩液可避免依赖超速离心机即可高效浓缩病毒；

（3）病毒滴度高：转染试剂NanoTrans 20™转染效率高，GFP对照质粒病毒滴度可达 10⁹TU/mL；

可应用于针对不同基因和药物靶标的临床前细胞学实验和整体动物实验。非常适合于病毒包装初试者。

其中NanoTrans ™ 转染试剂是佰欧晶新研发的一种以纳米材料为基础的便捷高效细胞转染试剂，适用于质粒、siRNA或其它形式的核酸包括DNA、RNA、寡核苷酸、以及核酸蛋白复合物等物质的转染，也可以用于活体动物的核酸转染以及用于基因治疗。

3.保存条件：

产品内容4 ^oC与-20 ^oC分开保存。

NanoTrans 20™ 4 ^oC条件下1年有效，包装辅助质粒MIX与GFP对照质粒-20 ^oC条件下2年有效，病毒浓缩液(1×)4 ^oC条件下1年有效，感染辅助试剂-20 ^oC条件下1年有效。

4.注意事项：

• 为了您的安全与健康，操作时请穿戴实验服、手套；

• 操作时请在生物安全柜或洁净工作台进行操作；

• 转染前必须保证细胞状态良好和传代次数；

• 制备NanoTrans-DNA复合物时，请不要使用含有血清的溶液；

• 阳性对照组设置：每次转染设置GFP对照组；

• 本产品仅限于专业人员的科学研究使用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品。

 慢病毒包装具体步骤：

（1）转染前30-60分钟，10cm培养皿加入5mL含血清和抗生素的完整培养基；

（2）准备两个洁净EP管，分别加入500μl无血清DMEM培养基，其中一管中加入5μg目的质粒（目的基因-穿梭载体重组质粒）与5μg包装质粒混合液，混匀；

（3）另一管中加入15μl NanoTrans转染试剂，混匀。

注意：切勿使用Opti-MEM稀释NanoTrans试剂和DNA。（Opti-MEM含有血清，会破坏转染复合物）

（4）立即将稀释的NanoTrans试剂一次性添加到稀释的DNA溶液中。

注意：不要以相反的顺序混合溶液！

（5）立即上下吸移3-4次或短暂涡旋混合。在室温下孵育10-15分钟，形成NanoTrans-DNA复合物。

注意：切勿将NanoTrans-DNA复合物保存超过20分钟。

（6）将 NanoTrans-DNA复合物滴加到培养皿中，轻轻旋转平板使混合液均匀分布。

（7）转染后4-6小时，取出含NanoTrans-DNA复合物的培养基，用10ml新鲜完整的含血清/抗生素的培养基替换。

（8）转染后48h收集病毒上清液，并补充10ml新鲜培养基至培养皿中，继续培养；

（9）转染后72h可进行第二次病毒上清收集，与48h收集的上清液混合后，500g离心10分钟，去除细胞碎片；

（10）使用0.45μm滤器过滤慢病毒离心后上清液；

（11）每10ml的过滤后病毒液，加入病毒浓缩液2.5ml，每20～30min充分颠倒混合一次，共进行3～5次；

（12）4℃静置过夜；

（13）次日，5200g，4℃，离心30min；

（14）吸弃上清，倒置离心管于喷有75%乙醇的洁净吸水纸上1～2min，直至吸尽残余液体（此时可观察到离心管底部有黄色或白色粉状沉淀属慢病毒沉淀）。

（15）加入适量的慢病毒溶解液（PBS或DMEM）溶解病毒沉淀，保存于-80℃备用。

注：病毒切忌反复冻融，冻融一次病毒滴度将下降10-20%，且-80℃保存的病毒最好在半年内使用效果最佳。

 慢病毒滴度检测（推荐流式细胞仪检测法）：

        滴度单位：TU/mL，指每毫升中含有的具有生物活性的病毒颗粒数。「TU」为「transducing units」的缩写，中文为「转导单位」，表示可以感染并进入到靶细胞中的病毒基因组数。

（1）具体步骤：

1. 细胞接种。提前一天将生长状态良好的 293 T 细胞消化计数后加入 24 孔板，500μl/孔（细胞数控制在1×10⁵/孔），每种病毒设置三个梯度；

2. 加入病毒前将24孔板中原有培养基弃去，加入新的含感染辅助试剂的培养基250μl/孔，感染辅助试剂用量为1:1000，如1ml培养基里加入1μl感染辅助试剂；

3. 在24孔板中加入病毒原液、病毒10倍稀释液、病毒50倍稀释液各1μl（即1μl/0.1μl/0.02μl三个梯度，若病毒滴度太高，还可继续往下稀释），混匀后放入培养箱培养。

   培养24h后，在每个孔再加入250μl 完全培养液，利于细胞的生长。

   培养72h后消化细胞，用PBS重悬一遍再离心，再用200μl PBS重悬后，将细胞悬液加入流式细胞管中，于流式细胞仪上测定含有荧光的细胞的百分比，并记录。

（2）病毒滴度计算方法：

目前公认以生长状态良好293T细胞为标准，其MOI值为1，也就是1个活性单位病毒能够成功感染1个293T细胞并让外源基因进行表达;以此方法计算，测滴度时24孔板铺的细胞量为1×10⁵个，假如感染效率为X%，也就是有1×10⁵×X%个细胞被成功感染，那么加入相应体积Yμl的病毒浓缩液中有1×10⁵×X%TU(TU为病毒单位，相当于个)有活性的病毒，而病毒滴度的单位为TU/ml，经换算得如下计算公式:

病毒滴度=1×10⁸×X%:Y（X%为病毒感染效率:Y为加入病毒浓缩液的体积，单位为μl）