一、ELISA概述

是免疫诊断中的一项新技术，现已成功地应用于多种病原微生物所引起的传染病、寄生虫病及非传染病等方面的免疫诊断。 也已应用于大分子抗原和小分子抗原的定量测定，根据已经使用的结果，认为 ELISA 法具有灵敏、特异、简单、快速、稳定及易于自 动化操作等特点。 不仅适用于临床标本的检查，而且由于一天之内可以检查几百甚至上千份标本因此，也适合于血清流行病学调查，本法不仅可以用来测定抗体，而且也可用于测定体液中的循环抗原，所以也是一种早期诊断的良好方法。因此 ELISA 法在生物医学各领域的应用范围日益扩大，可概括四个方面：

1. 免疫酶染色各种细胞内成份的定位，

2. 研究 抗酶抗体的合成

3. 显现微量的免疫沉淀反应

4. 定量检测体液中抗原或抗体成份

二、ELISA实验目的

酶联免疫吸附测定(enzyme-linkedimmunosorbentassay 简称ELISA) 是在免疫酶技术(immunoenzvmatictechniaues)的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术ELISA过程包括抗原(抗体)吸附在固相载体上称为包被，加待测抗体(抗原)再加相应酶标记抗体(抗原) 生成抗原(抗体)--待测抗体(抗原)--酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸收计算抗体(抗原)的量。待测抗体(抗原)的定量与有色产生成正比。   

用于免疫酶技术的酶有很多，如过氧化物酶，碱性磷酸酯酶，B-D-半乳糖苷酶，葡萄糖氧化酶 碳酸酐酶，乙酰胆碱酯酶，6-磷酸葡萄糖脱氧酶等。常用于ELISA法的酶有辣根过氧化物酶，碱性磷酸酯酶等，其中尤以辣根过氧化物酶为多。由于酶摧化的是氧化还原反应，在呈色后须立刻测定，否则空气中的氧化作用使颜色加深，无法准确地定量。辣根过氧化物酶(HRP是一种糖蛋白，每个分子含有一个氧化血红素(protonhemin)区作辅基。酶的浓度和纯度常以辅基的含量表示。氯化血红素辅基的最大吸收峰是403nmHRF，酶蛋白的最大吸收峰是275nm，所以酶的浓度和纯度计算式是：已知HRF的A(1cm 403nm 1%)=25，式中1%指HRP百分浓度为100ml含酶蛋白1a即10mg/ml，所以酶浓度以ma/ml计算是：HRF的A(1cm403nmm/ml=25HRP纯度(RZ)=A403nm/A275nr,纯度(RZReinheit Zahl)值越大说明酶内所含杂质越少。高纯度HRP的RZ值在30左右，最高可达34，用于ELISA检测的HRP的RZ值要求在30以上。

三、ELISA检测原理：

1. 使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。

2. 使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。,

3. 用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。

4. 加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。

四、ELISA常用的四种方法

1. 直接法测定抗原

(1) 将抗原吸附在载体表面;

(2) 加酶标抗体，形成抗原-抗体复合物;

(3) 加底物。底物的降解量=抗原量。

2. 间接法测定抗体

(1) 将抗原吸附于固相载体表面;

(2) 加抗体，形成抗原-抗体复合物;

(3) 加酶标抗体;

(4) 加底物。测定底物的降解量=抗体量

3. 双抗体夹心法测定抗原

(1) 将抗原免疫第一种动物获得的抗体吸附于固相表面加抗原，形成抗原-抗体复合物;

(2) 加抗原免疫第二种动物获得的抗体，形成抗体抗原抗体复合物;

(3) 加酶标抗抗体(第二种动物抗体的抗体);

(4) 加底物，底物的降解量=抗原量。

4. 竞争法测定抗原

(1) 将抗体吸附在固相载体表面;

(2) 加入酶标抗原;

(3) 加入酶标抗原和待测抗原;

(4) 加底物，对照孔与样品孔底物降解量的差=未知抗原量。

MDSM30064-小鼠PD-1定量分析酶联免疫检测试剂盒.doc